蛋白质组学面临的新问题

        摘要：蛋白质组学领域仅仅经历了十年的发展历程。虽然它还有许多棘手的问题尚待解决，但是研究人员坚信蛋白质组学能够发现新的药靶和生物标记物，从而可以改进诊断和治疗过程。本文选择此领域内几家瑞士公司的工作进行评述。

Proteomics Deals With New Realities

Julie A. Smith-Morrow

Abstract: The field of proteomics is only about 10 years old, and even though it present the research community withy daunting problems, the belief is widely held that proteomics has the capacity to identify new drug targets and biomarkers that will significantly advance diagnostics and therapeutics. The contributions of a selection of Swiss companies to the field are reviewed in this article.

        瑞士，以其经济和政治稳定而著称，被誉为全球前沿科技的商业中心。正如今年四月份由瑞士投资促进局--国家内部投资促进机构资助的媒体巡回报道所强调的，最近几年瑞士已成为生物技术产业的主要焦点之一。尽管瑞士只有700 万人口，但其经济发展状况不能以其大小来衡量。作为世界上许多制药巨头的总部，它在生物技术领域也逐步走向领袖位置。它的中心位置、一流的基础设施、高质量的生活水平，以及技术水平高并受过高等教育的劳动力，这些得天独厚的条件使其逐渐走向生命科学产业的前沿。
        蛋白质组学是多家瑞士公司从事的一个生物技术领域，其中包括日内瓦地区的GeneProt 和GenBio。在20 世纪90 年代，人们在从对基因组学成就的失望中醒悟过来时，蛋白质组学悄然而生。随着20 世纪90 年代末人类基因组测序的完成，人们清楚地认识到人类基因数目的总数不是原先估计的300 000、100 000 或50 000，而仅仅只有20 000~30 000。不仅基因的数目远比人们预测的要少，而且比人类更加简单的生物体中，如果蝇，基因数目也在20 000 左右。这使得研究者们不得不得出产生差异性的真正原因很有可能是蛋白质组存在差异的结论。尽管如何拼凑信息以产生大量表征物种属性蛋白的机理尚未明了，但人们认为蛋白质的后转录修饰似乎在产生大量非相似蛋白中起着重要的作用，而这些蛋白是高级生物体功能执行所必需的。今天，蛋白质组学覆盖了蛋白质发现、蛋白- 蛋白相互作用，以及蛋白质表征等领域[1]。
        GeneProt 公司创建于2000 年，并在2000 至2002 年之间获得了$150 000 000 的风险投资基金。它与Novartis (Basel, Switzerland)进行了广泛的合作，后者为其提供了$50 000 000 的经费。在2003 年，GeneProt 将其第一个具有治疗意义的蛋白授权给Novartis。GeneProt 的方法是将蛋白测序、识别技术与大规模计算机潜能结合在一起，识别在正常和疾病状态下表达的差异蛋白质。这需要成对地分析来源于个体匹配的健康人与病人的样品。血浆或者血清是进行这类分析的对象，这是因为它们可以通过非侵害的方法获得，而且它们还含有来源于体内许多不同器官的蛋白。
        由于体液中蛋白和肽都具有很宽的浓度范围，因此开展这些研究是具有很大挑战性的。事实上，白蛋白是血清蛋白中丰度最高的蛋白，其浓度是肿瘤坏死因子（TNF）的万亿倍。通常的分析方法是先去除丰度较高的几种蛋白质，再通过凝胶过滤进行富集。然后采用多维色谱分离进一步降低它的复杂性。最后样品酶解后通过质谱进行分析[2]。
        GeneProt 技术所面临的最大挑战是要求方法具有极高的稳定性，从而可以进行不同疾病状态样品的比较。
        比较这类样品常用的技术就是利用重同位素标记（13C，18O，或者15N）两个样品中的一个，然后将它们混合在一起。分子质量的变化会导致其中的一个峰相对另一个峰发生微小的偏移。这种分析方法被广泛地用于比较菌株和组织培养株。在培养过程中，可以将同位素加在细胞生长的基质中。然而对人的样品标记蛋白是不切实际的，因此最好的方法就是使用更加通用的化学标记多肽。
        尽管利用16O 到18O 的变化可以开展比较蛋白质组学研究，但GeneProt 则发现对于疾病蛋白，仅仅通过峰强度的变化就有可能检测蛋白的差异表达。
        在过去的四年里，当小型生物技术公司将注意力转移到蛋白质组学时，许多制药公司则已经开始发展自己的蛋白质组技术。这些公司包括Roche (Nutley, NJ)、Bristol-Myers Squibb (Princeton, NJ)，以及Novartis，尽管它还继续保持与GeneProt 的合作。
        在长期治疗艾滋病和某些类型癌症上取得的成功，促使许多制药公司开始考虑许多慢性疾病的治疗，其中包括与老龄化过程相关的疾病。随着全球人口寿命的增长，伴随而来的认知损伤和老年痴呆已经成为医疗保健和公共健康系统的一个重要负担。现在全球约有6 亿老龄人。在2020 年前，世界卫生组织预测在发展中国家和发达国家里将有290 万老年精神病患者，其中阿兹海默症是主要病因。当前，在西方经济最发达的7 个国家里，患有阿兹海默症疾病的人数就有500 万。该病目前还无药可治，经济上的负担给全球医疗保健服务系统造成了极大的压力[3, 4]。
        当前对阿兹海默症致病机理的探讨主要是针对淀粉质前导蛋白（APP），这是一种神经系统常见成分。在发病过程中，APP 可以转化成β - 淀粉肽（Abeta）。在损伤情况下，β - 淀粉肽会在脑部积累成淀粉斑。在这个过程中，β - 分泌蛋白酶，一种APP 裂解酶（BACE），将会参与反应。尽管这些蛋白可能是这种疾病的主要标志，但并不排除其他蛋白参与的可能。在阿兹海默症疾病的致病机理上，科学家们还没有达成共识。GeneProt 已经开始将阿兹海默症作为他们其中的一个主要目标，并且通过比较阿兹海默症病人和健康人的蛋白谱找到了大量的差异蛋白。一些公司和非营利性研究机构正通过外部合作研究这些差异蛋白。
        许多在20 世纪90 年代成立的蛋白质组学公司发现它们正处于股票市场崩溃和最初美好期望破灭的境地。2002 年，Glaucus Proteomics 公司在一系列融资失败后倒闭。Oxford Glycoscience 公司在其所有者Celltech PLC（Berkshire,U.K.）公司没有找到买家后关闭。而MDS Proteomics 公司则被重新组建成Protana (Toronto,Ontario, Canada)公司。
        大型药物公司在开发药物时遇到的挑战表现得尤为突出。尽管在2002 年美国药物公司在研究开发上投入了320 亿美元，但自1996 年后新药的产出却急剧下降。这从美国食品与药物管理局批准“新分子实体”的缓慢效率上就可以看出这种糟糕的状况。到2004 年10 月末他们只批准了16 种药物。为了避免这种缓慢的操作程序，许多大型药物公司开始将注意力集中在药物加工上，而不是继续从事新药开发。新药研发的巨大投入的失败使得许多主要的制药公司更多地开始委托小公司从事这方面的研究。
        蛋白质组学被人们誉为一种新兴的、系统的发现新药的方法。尽管采用一些私营公司和学术研究人员开发的技术发现了许多新蛋白，但是发现的潜在药物靶点太多了。现在的问题是缺少好的靶点。因此，蛋白质组学研究不仅仅需要找到疾病的靶点，而且还要找到能够诊断出潜在慢性病患者或对新的治疗具有特殊响应的蛋白标记物。这些标记物不仅可以用于监测长期不断变化的疾病（如阿兹海默症） 的治疗过程，而且还能降低慢性病的长期临床实验费用。
        为了克服大规模蛋白质组筛选带来的一些问题，一些研究者开始采用一种抗体片段和细胞检测结合的目标方法。坐落于Z ü rich 郊外的Schlieren 生物技术中心ESBATech 公司就采用这种策略。该公司创建于1998 年，主要从事重组抗体工程， 包括单链抗体片段（scFv）。通过一个灵活的连接臂，将带有可变轻链的抗体和可变重链相连就构成了单链抗体片段[5]。
        由于分子尺寸较小，而且结构简单，单链抗体具有临床医学应用的潜能，包括治疗与诊断。然而，它们不太稳定且在循环过程中半衰期太短。这种不稳定性将导致表达系统产量低，从而极大地限制了它们的实用性。针对这种现象，ESBATech 公司设计了一种稳定性和溶解度俱佳的克隆抗体片段的系统，这种抗体片段与抗原键合能力无关。
        由于细胞内部环境在本质上逐渐缩减，因此当内部表达时，单链抗体很难保持稳定的链内二硫键。SBATech 的科学家充分利用酵母中一种可挑选的系统来寻找稳定的抗体。他们设计了一种由scFvs 构成的融合蛋白库。ScFvs 含有可变抗体区域结合到突变Gal11 肽上的整个人类基因库。前期研究表明当可变抗体结合到Gal4 蛋白时，它能够活化基因的转录和细胞的存活。在Gal11 肽的附近，他们还设置了一个Gal4 蛋白的转录活化区。然而，只有当融合蛋白在细胞内部稳定且可溶时，基因活化才可能发生（图1）。因此，只有稳定可溶的scFv 才能确保复合体的存活。这个系统可以被用来从人类基因库中选择少数几个能携带固有特性最佳的scFv 结构，用来产生抗外（内）细胞疾病靶点相关的专一性抗原结合剂。
        抗体通常被用来识别基因产品的特性，包括分布、表达水平和复合物的形成。结合高通量的数据库，这些特征都能被用来识别药物靶点[6]。通常情况下，充分表征的抗体被单独用于测定基因产品的性质（如组织分布和表达水平上的变化）。但和DNA 芯片不同，它不能用于大规模的样品评价。
        蛋白质阵列是当前高通量研究方法之一。它将抗原固定在固体表面，并和ESBATech 等公司开发的库中的抗体结合。由于ESBATech 的方法包含一个内细胞的选择步骤，因此是一种能产生用于细胞内治疗抗体的理想方法。例如为查清致病过程，可以通过抑制caspase蛋白来阻止细胞凋亡。
        由于目前还没有新药是通过蛋白质组学研究发现的，因此该途径还存在很多问题。一些公司开始发展更复杂的系统生物学方法，即采用基因组学、蛋白质组学和代谢物测定相结合的方法来研究药物对模型系统的影响。该方法被认为是一种推动药物发现的更完整、更有效的方法[7]。

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        蛋白质组领域经过10 年的发展，在去年遭到了很大的挫折。这主要是因为其在新药发现中的能力受到质疑。我们不得不在未来的几个月甚至几年里，在开展蛋白质组学研究的同时，重新审视这个问题。
参考文献：

• Heller M, Mattou H, Menzel C, Yao X. Trypsin catalyzed 16O to 18O exchange for comparative
  proteomics:tandem mass spectrometry comparison using MALDITOF, ESI-QTOF, and ESIion trap mass spectrometers. J Am Soc Mass Spectrom, 2003, 14(7): 704-18.
• Rose K, Bougueleret L, Baussant T, et al. Industrial-scale proteomics: from liters of plasma
  to chemically synthesized proteins. Proteomics, 2004, 4(7): 2125-50.
• Dumoulin M, Dobson CM. Probing the origins, diagnosisand treatment of amyloid diseases using antibodies. Biochimie, 2004, 86(9-10): 589- 600.
• Standridge JB. Pharmacotherapeutic approaches to theprevention of Alzheimers disease. Am J Geriatr Pharmacother, 2004, 2(2): 119-32.
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