[经验交流] 血清中胆汁酸的高效液相色谱荧光测定及质谱鉴定

作者:石运伟，赵先恩，陈向明，张海峰等

摘　要　在Hypersil C18色谱柱上,利用新型荧光试剂1, 22苯并23, 42二氢咔唑292乙基对甲苯磺酸酯(BDETS)作柱前衍生化试剂,采用梯度洗脱对10种胆汁酸(BAs)荧光衍生物进行了优化分离。95℃下在二甲基亚砜溶剂中以柠檬酸钾作催化剂,衍生反应30 min后获得稳定的荧光产物,衍生反应完全。激发和发射波长分别为λex=333nm,λem=390 nm。采用大气压化学电离源(APCI)正离子模式,实现了血清中胆汁酸的定性和定量测定。线性回归系数均在0. 9996以上,线性范围宽,检出限为12. 94～21. 94 fmol。
关键词　高效液相色谱-质谱,荧光检测,柱前衍生,血清,胆汁酸
1　引　　言
    胆汁酸是动物体内重要的代谢调节物质,其分子具有良好的界面活性,能使疏水分子在水中乳化便于消化吸收,而且能防止胆石的形成,肝病患者的血液中胆汁酸含量会明显增加[1] 。但这类化合物在紫外-可见光区无吸收也无荧光,用折光示差检测[2]或远紫外波长检测[3]灵敏度不高。近年来,包括化学衍生在内的气相色谱/质谱法(GC /MS) [4, 5]和HPLC2MS( 2MS) [ 6～8 ]检测都有报道,与传统的检测方法相比HPLC荧光检测具有很高的灵敏度,所用衍生试剂主要有香豆素类和磺酸酯类化合物,但香豆素类[ 9～11 ]化合物对潮气及水不稳定; NOEPES磺酸酯[12 ] 、NE2OTf[ 13 ]和AE2OTf[ 14 ]对羧酸的衍生化都需在碱性催化剂和冠醚相转移试剂的存在下,于苯或甲苯溶剂中完成,分离需预处理,费时费力且毒性大。
    本实验采用新型荧光试剂1, 2-苯并-3, 4-二氢咔唑-9-乙基对甲苯磺酸酯,在柠檬酸钾催化剂的存在下,于二甲基亚砜(DMSO)溶液中实现了10种共轭和非共轭胆汁酸的快速衍生化。采用梯度洗脱实现了10种胆汁酸衍生物的完全基线分离,并进行了柱后在线质谱定性。对正常人血清中胆汁酸进行了准确的测定,方法操作简便,灵敏度高。
2　实验部分
2. 1　仪器与试剂
    1100型高效液相色谱-质谱联用仪(Agilent公司) ,配备四元梯度泵, 100位自动进样器,荧光检测器,在线真空脱气机,大气压化学电离源(APC I) ; Hypersil C18色谱柱(4. 6 mm ×200 mm, 5μm,中国科学院大连化学物理研究所) 。1, 2-苯并-3, 4-二氢咔唑-9-乙基对甲苯磺酸酯(自制) ; 胆汁酸标准样品(Sigma公司) ;无水乙腈(禹城化学试剂厂) ,用P2O5 干燥后蒸馏处理,二甲基亚砜经减压蒸馏后备用;柠檬酸钾、酒石酸钠等均为分析纯,实验用水由Milli2Q超纯水系统制备。
2. 2　标准溶液的配制
    准确称取定量胆汁酸标准品,用乙腈配成1. 0 ×10- 3 mol/L 的溶液。称取208. 5 mg的1, 2-苯并-3, 4-二氢咔唑-9-乙基对甲苯磺酸酯(BDETS)用二甲基亚砜定容至10mL,浓度为5. 0 ×10- 2 mol/L。相应低浓度的衍生试剂(5. 0 ×10- 4 mol/L)标准溶液用二甲基亚砜稀释,低浓度胆汁酸(5. 0 ×10- 5mol/L)标准溶液用无水乙腈稀释而成。
2. 3　标准品的衍生过程
    盛有500 mg柠檬酸钾催化剂的安培瓶中依次加入100 mL DMSO, 50μL混合胆汁酸溶液, 150μL衍生试剂溶液,封口后于95℃恒温水浴下振荡反应30 min。取出放冷后加入300μL乙腈混合均匀,取上层溶液用乙腈水溶液(CH3 CN /H2O, 1∶1,V /V )稀释5倍直接进样分析。衍生反应概况见图1,胆汁酸分子结构见图2。
2. 4　色谱条件
    色谱柱: Hypersil C18色谱柱( 4. 6 mm ×200 mm, 5 μm ) 。流动相A: 50%乙腈水溶液(含有40 mmol/L的HCOONH4 , pH = 3. 5) ; B: 100%的乙腈。梯度洗脱程序为0%B 35 min线性梯度到70%B,到40 min线性梯度到100%B, 100%B再运行15 min。流速为1. 0 mL /min,柱温30℃。荧光激发和发射波长分别为:λex = 333 nm,λem = 390 nm。
2. 5　质谱条件
    1100型高效液相色谱-质谱联用仪;大气压化学电离源(APCI) ,正离子模式,喷雾压力0. 42 MPa;干燥气流量为5 L /min,干燥气温度350℃,气化温度450℃; 毛细管电压3500 V,电晕电流4000nA( Pos) [ 15, 16 ] 。
3　结果与讨论
3. 1　衍生条件的优化
    1, 2-苯并-3, 4-二氢咔唑-9-乙基对甲苯磺酸酯与胆汁酸的衍生化随溶剂、催化剂、衍生温度及衍生试剂用量的不同产率有显著差异。实验中选用一系列弱碱性催化剂(K2CO3、NaH2 PO4、K2 C2O4、NaCN、乙酸钠、柠檬酸钾、酒石酸钠、硼砂等)对衍生化产率进行了考察,以GDCA、GUDCA共轭胆汁酸和UD-CA、CDCA非共轭胆汁酸衍生物为例作图3。碱性稍强(K2 CO3、硼砂、NaCN、NaH2 PO4 )会引起5种共轭型胆汁酸酰氨键的水解,造成此5种胆汁酸衍生物荧光信号大幅度降低而水解,产生的相应5种非共轭型胆汁酸所形成的衍生物荧光信号大幅度增加;碱性稍弱(乙酸钠、酒石酸钠、K2 C2O4 )会使催化效率降低,明显影响衍生产率。最终选择碱性适中的柠檬酸钾作为衍生反应的催化剂,并对其用量从50～600mg进行了考察,结果表明:用量在500 mg产率最大。
    选取二甲基亚砜(DMSO) 、N,N-二甲基甲酰胺(DMF) 、四氢呋喃( THF) 、1, 4-氧六环、吡啶、2-甲基吡啶、乙腈及丙酮等作为衍生化溶剂,对衍生产率进行了考察。结果表明,在其它衍生条件相同的情况下,DMSO具有最大衍生化产率。衍生产率和速率随温度的升高而增加, 95℃衍生反应30 min后产物信号强度基本稳定,升高温度会引起衍生试剂轻度分解而影响衍生产率,而且选取95℃进行衍生具有良好的衍生速率, 30 min反应近乎完全。衍生试剂过量10到15倍促使衍生反应完全,由于试剂自身的荧光猝灭,过量衍生试剂不会干扰分离,本实验用15倍的衍生试剂提高衍生产率。
3. 2　色谱分离及质谱检测
    按上述优化条件,对10种胆汁酸进行衍生后,采用梯度洗脱在55 min内实现了完全基线分离,结果见图4。利用上述质谱条件进行柱后在线鉴定, 以胆酸(CA)为例的质谱见图5 (分别为一级和二级质谱) ,各组分一级质谱数据见表1。
3. 3　线性回归方程、检出限和测量精密度
    注射量在600 pmol～36. 6 fmol范围内,依据峰面积和实际进样量进行线性回归,所得回归方程、相关系数和各胆汁酸检出限见表1。线性相关系数在0. 9996～0. 9999之间。各胆汁酸衍生物检出限(按照信噪比为3来计算, S /N = 3∶1)在12. 94～21. 94 fmol之间。
    在相同洗脱条件下,对100 pmol胆汁酸衍生物进行平行6次分析,保留时间和峰面积的测量精密度很高,结果见表2。
3. 4　实际样品分析
3. 4. 1　血清中胆汁酸的提取　
    向盛有2 mL血清样品的离心试管中加入3 mL甲醇并振荡摇匀,然后加入0. 5 g硫酸铵固体超声振荡,离心后取出有机相用氮气吹干,剩余物用300 mL DMSO溶解后加入6. 7 mL水。然后用经过4mL 甲醇和5mL水冲洗的C18 Sep-Pak萃取柱过滤,再用5 mL水冲洗萃取柱,然后用5 mL乙腈将胆汁酸洗脱,将洗脱液挥发至干用300 mL DMSO溶解冷藏备用。
3. 4. 2　血清样品中胆汁酸的测定　
    按照2. 4实验条件,实际样品的色谱分离见图6;各胆汁酸的测定结果见表3。实际血清样品中GCA、GUDCA、GCDCA、CA、CDCA、DCA、LCA除采用保留值定性外同时进行了质谱确定; GDCA、UDCA、GLCA由于含量底于检出限度未能进行定量。
3. 5　结论
    胆汁酸测定方法的建立对于临床及生命科学都有重要意义。实验利用1, 2-苯并-3, 4-二氢咔唑-9-乙基对甲苯磺酸酯作为柱前衍生化试剂,对衍生化条件和色谱分离条件进行了优化,并施以柱后在线质谱鉴定,建立了灵敏、快速测定血清中胆汁酸的方法。衍生试剂稳定、灵敏,能快速方便的与胆汁酸进行衍生反应且衍生产率高、衍生产物稳定。此方法能够准确定量且具有线性范围宽、重现性好等优点。对血清样品的测定结果与众多文献基本相符。结果表明:此分析测定方法的可行性好,能够为临床及生命科学的研究提供可靠的数据参考。

参考文献（略）