作者:王少坤,朱好勤,杨娴,李晓燕
摘要 在硅胶G 薄层板上采用一步展开的方法进行二维色谱电泳。为此, 设计了一种新的装置, 在常规薄层板的两边设置一与展开方向垂直的水平电场, 使色谱过程与电泳过程同时进行。实验证明了该方法的可行性, 在该过程中横移值随电压的升高而变大; 以黄柏和甘草为例, 比较了新方法与传统方法的异同。实验结果表明: 新方法提高了系统的分离度。
关键词 一次展开; 二维色谱电泳; 黄柏; 甘草
1 实验部分
1.1 材料与试药
对照品(盐酸小檗碱, 巴马汀, 甘草次酸)以及对照药材(黄柏, 甘草) 均由卫生部药品及生物制品检定所提供。
对照品溶液: 取对照品, 加甲醇分别配成每1m l 含1m g 的溶液。黄柏供试液: 取黄柏对照药材1.0 g, 加甲醇5.0 m l, 浸渍过液,过滤, 滤液浓缩至1.0 m l。
S1 和S2 两种溶剂系统: S1 为正丁醇-醋酸-水(7∶2∶1) ; S2 为正丁醇-3mo l/L 氢氧化铵-乙醇(5∶2∶1) , 临用前配制。所用试剂均为分析纯试剂。
0.5% CMC-N a 硅胶G (分析纯, 青岛海洋化工厂生产) , 薄层板(100 mm ×200 mm×2 mm ) , 事先用铅笔按5.0 mm (横向) ,10.0 mm (纵向) 的间隔画出网格(以便于读取斑点迁移的距离) , 置105℃活化1 h 后, 置干燥器放冷, 备用。
1.2 不同电压下的色谱-电泳过程
将盐酸小檗碱对照品溶液2uL 点于薄层板的中间(距底端20 mm ) , 按图1 连接各装置。加入S1 溶剂, 接通电源, 用胶带封闭层析缸, 按固定间隔时间(5 m in) 记录不同时间斑点的横移值和纵移值。电压设定分别为:6000 V , 8000 V , 10 000 V。
1.3 黄柏分离方法的比较
取黄柏对照药材溶液与盐酸小檗碱及巴马汀化学对照品溶液各5 uL, 分别点于薄层板上(盐酸小檗碱与巴马汀对照品溶液点于同一位置) , 采用S1 溶剂系统, 在6000V 电压下(约660 V /cm ) 进行色谱-电泳实验; 在同条件下进行常规TLC 实验, 比较两种图谱。
1.4 甘草分离方法的比较
按文献所述方法[ 7 ]制备甘草对照药材供试液。取上述供试液及甘草次酸对照品溶液各5 uL, 分别点于薄层板上, 采用S2 溶剂系统在6000V 电压(约660V.cm ) 下进行色谱-电泳实验; 在同样的条件下进行常规TLC 实验, 比较两种图谱。
2 结果与讨论
2.1 可行性的证明
按“1.2”项下条件进行实验, 在展开过程中改变电场方向, 结果, 盐酸小檗碱横移方向也随之改变(图2)。该实验排除了小檗碱在色谱-电泳过程中的横移是由于非电场因素(譬如溶剂边缘效应等) 所致的可能性。此外,盐酸小檗碱横移的方向揭示了带正电荷的化合物(如季铵盐) 将向阴极方向移动。
2.2 横移和电压的关系
不同电压下的色谱-电泳实验揭示了横移与电压之间的关系。为了减小非相关因素(譬如薄层板间的差异等) 的影响以纵移值为横坐标, 以横移值为纵坐标作图(图3)。该图表明, 横移值随电压的增高而变大。
2.3 与常规薄层色谱法分离结果的比较
黄柏与甘草是常用中药, 已经深入研究。选取这两个样品作为研究对象主要是为了比较新方法与常规方法所获分离结果。
2.3.1 黄柏 比较两图谱可以看出, 盐酸小檗碱与巴马汀在色谱-电泳实验中不但产生了纵移并且也产生了不同程度的横移。合成运动的结果导致了两斑点间的距离增大。其关系符合:
C = a2 + b2
其中a 为两斑点纵移值(色谱迁移) 之差, a=a2- a1; b 为两斑点横移值(电泳迁移) 之差, b= b2- b1; C 为两斑点间的距离。
显然, 横移的产生增大了两斑点间的距离, 从而改善了分离度。
黄柏色谱-电泳实验分离度的改善率为10.87% (R SD = 0. 125%)。见表1。此外, 值得一提的是在常规TLC 图谱中呈拖尾状的黄色荧光谱带, 在色谱-电泳图谱中呈分离的荧光斑点(图4)。
2.3.2 甘草 作为一混合物, 甘草不但含有机酸也含生物碱[ 8 ]。图5 显示出在色谱-电泳过程中, 既有朝正极方向迁移的带负电的组分, 也有朝负极迁移的带正电的组分。甘草的色谱-电泳展示出一种二维三方向的图谱(图5)。
在排除了非电场因素的影响以及建立了场强与横移关系后, 盐酸小檗碱在电场中的横移结果证明了新方法的可行性。该新方法只需一个步骤, 一种溶剂系统, 可获得二维图谱。与经典TLC 相比, 新方法表现出了分离度的改善、简单、快速的优点。新方法为在硅胶G 薄层板上分离混合物提供了一种新的手段。
参考文献(略)
粤ICP备05143847