毛细管电泳法测定复方鱼腥草片中的绿原酸和槲皮素

作者:吕元琦，邬春华，袁倬斌
    摘要：建立了毛细管电泳法分析复方鱼腥草片中绿原酸和槲皮素的方法，通过研究缓冲溶液酸度和浓度、工作电压和进样时间的影响优化了分析条件。在优化的条件下，15min内实现了两种分析物质的良好分离。绿原酸和槲皮素峰高和质量浓度分别在0.05～0.80g／L和0.05～1.00g／L范围内成良好线性。基于迁移时间和峰高的重复性(RSD)分别为：绿原酸，1.91％和4.32％；槲皮素，2.30％和3.18％。绿原酸和槲皮素的检出限(S／N=3)分别为0.014g／L和0.015g／L。通过分析实际样品并做加样回收实验进一步验证该方法的可行性。
    关键词：毛细管电泳(CE)；绿原酸；槲皮素；复方鱼腥草片
    中药复方制剂复方鱼腥草片含有鱼腥草、黄芩、板蓝根、连翘和金银花5味中药成分，具有清热解毒之功效，可用于外感风热引起的咽喉疼痛、急性咽炎和扁桃腺炎有风热症候者等。目前，复方鱼腥草片的质量标准仅有定性鉴别方法，建立准确、可靠的复方鱼腥草片成分的定量分析方法对控制产品质量、保证药物疗效具有重要的意义。赵萍等⋯ 利用高效液相色谱法(HPLC)测定了复方鱼腥草片的改良型药物复方鱼腥草合剂中的黄芩甙，为该类药物质量控制建立了一种可供选择的分析方法。与HPLC相比，毛细管电泳(CE)具有分离速度快、分离效率高、样品及试剂消耗量少和毛细管柱寿命长容易清洗等优点，近年来在中草药成分分析中逐渐得到应用推广。绿原酸是金银花和鱼腥草的活性成分之一，槲皮素是鱼腥草的活性成分之一。因此，准确测定复方鱼腥草片中绿原酸和槲皮素的含量具有比较重要的意义。本文利用CE分析了复方鱼腥草片中的绿原酸和槲皮素，虽然已经有CE测定绿原酸和槲皮素中两种物质的报道，但复方药剂中绿原酸和槲皮素的CE分析却未见报道。
    1 实验部分
    1．1 主要仪器设备与操作条件
    1229高效毛细管电泳仪(北京新技术研究所)配有固定波长紫外检测器；检测波长254nm，未涂层弹性石英毛细管柱(50cm×50μm，河北永年光导纤维厂)，工作电压l6kV，静压力进样(高度10cm，时间6s)；背景电解质为pH 8.5的30mmol／L硼砂缓冲溶液(用0.2mol／L HAc和0.1mol／L NaOH调pH)，使用前超声脱气10min；pHS-3B型酸度计(上海雷磁仪器厂)。毛细管使用前用0.10 mol／L NaOH、水和pH8.5的30 mmol／L硼砂缓冲溶液依次清洗10 min，每次电泳后分别用0.10mol／LNaOH、水和pH8.5的30mmol／L硼砂缓冲溶液依次清洗2、3、5min。
    1．2 试剂
    槲皮素(Sigma公司)，绿原酸(对照品，中国药品生物制品检定所)，复方鱼腥草片(广州巨虹药业有限公司，批号20020702)，其他试剂均为分析纯，水为二次石英蒸馏水。
    1．3 标准溶液及样品溶液制备
    准确称取一定量绿原酸、槲皮素分别用无水乙醇溶解并定容至2g／L。使用前用无水乙醇稀释到一定浓度并用0.45μm醋酸纤维滤膜过滤。
    取复方鱼腥草片多片去糖衣，在玛瑙研钵中研成细粉，取一定量加入20mL 60％(φ)乙醇溶液浸泡4h，超声l h，过滤将滤液用60％(φ)乙醇定容至25mL。
    2 结果与讨论
    2．1 实验条件的优化
    2．1．1 缓冲溶液pH与浓度的影响在pH 7.0～9.5的范围内研究了pH对电泳迁移的影响。结果表明．随着pH的增加两种分析物的迁移时问增加，分辨率增加。这可能是由于随pH增加，电渗流和分析物电泳迁移速度均增加，两者方向相反，前者增加的程度大于后者的缘故。标准以及实际样品电泳实验表明，pH大于等于8.5时能够实现两种分析物的良好分离，本文选择pH 8.5作为最佳缓冲溶液酸度。
    在10～50 mmol／L范围内研究了缓冲溶液浓度对电泳分离的影响。结果表明，随着缓冲溶液浓度增加，两种分析物的迁移时问增加，分离度提高。考虑到缓冲溶液浓度过高会使焦耳热效应明显，造成基线噪音增加，影响检测，本文选择30mmol／L的硼砂缓冲溶液。
    2，1．2 工作电压的影响在12～20kV范围内研究了工作电压的影响。结果表明，在l2～20kv范围内两种分析物峰高变化很小。两种分析物的迁移时问和分辨率均随着工作电压的升高而降低。实验中同时发现，随着工作电压的升高，基线噪音增加，使检测灵敏度降低，当工作电压超过l6kv后这种影响变得明显。综合考虑分离度、峰高和灵敏度等因素，选择l6 kv的工作电压。
    2、1．3 进样时间的影响在2～l0s进样时问范围内研究了进样时问的影响。结果表明，随着进样时问增加，两种分析物峰高增加，峰宽增加。当进样时间超过6s后，峰高变化减慢，但峰展宽加剧，本文选择6s的进样时间。
    2．2 线性范围、重复性和检出限
    在上述优化的条件下，两种分析物l5min内能够实现良好分离。对分析物的线性进行研究，以峰高(y，mV)对质量浓度(x，g／L)作图，发现绿原酸和槲皮素峰高和质量浓度分别在0.05～0.80 g／L和0.05～1.00g／L质量浓度范围内成良好线性，线性方程分别为Y=43.3964x+0.047 l(r=0.9992)和Y=39.2679x一0.0705(r=0.9973)。通过连续注射含有绿原酸和 皮素分别为0.50g/L和0.60g／L的标准混合溶液计算了重复性，绿原酸和槲皮素迁移时间和峰高的相对标准偏差(n=5)分别为1.91％、2.30％和4.32％、3.18％。利用3倍噪音法得到绿原酸和槲皮素的检出限分别为0.014g／L和0.015g／L。
    2．3 样品分析
    利用所建立的方法分析了复方鱼腥草片中的绿原酸和槲皮素，根据标准加入法定性。向样品中准确加入一定量的绿原酸和槲皮素，做加样回收实验。
    3 结 论
    通过优化分离条件，建立了CE分析复方鱼腥草片中绿原酸和槲皮素的方法，实际样品分析及加样回收实验结果表明该方法快速、准确、可靠，为该类药物质量控制的有效分析方法。
参考文献：
[1] 赵萍．HPLC法测定复方鱼腥草合剂中的黄芩甙[J]．中草药，2002，33(6)：516—517．
[2] 郑一宁，谢天尧，莫金垣，等．双黄连粉针剂中黄芩苷的高效毛细管电泳-电导法测定[J]．分析测试学报，2001，20(6)：20—24．
[3]曹玉华，汪云，毛细管电泳电化学检测法测定胡黄连中香草和魏酸的含量[J]．分析测试学报，2003，22(6)：