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[经验交流] 共聚焦显微镜上能加细胞培养装置吗?

test123

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2008-10-04 20:55 | 只看楼主 树型| 收藏| 小中大 1^#

共聚焦显微镜上能加细胞培养装置吗?

转自中国显微镜图像网

问个初级问题? 共聚焦显微镜上能加细胞培养装置吗?那位有经验?

打听了一下,据说倒置显微镜上加大的培养箱能保证培养环境更长久,小培养箱操作方便,决定选小的,毕竟每次都要开那两个小门挺麻烦的.

但还是要问在稳定性方面,小培养箱比大的能差多少;另外如何解决小培养箱爱结水气的问题(壁内凝结,影响观察)

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2008-10-04 20:56 | 只看楼主 树型| 收藏| 小中大 2^#

个人观点，小的比大的更稳定。因为要维持的只是很小环境内的稳定。而大型培养箱需要维持的环境太大了。目前我了解的，还没有能在那么大的培养箱内维持稳定的CO2浓度的。一般还需要再加一个小培训箱。
使用大的培训箱的好处是可以维持整个显微镜处于稳定的环境中。因为热胀冷缩对显微镜镜体的影响也非常大。上下一度的差异会引起焦点的明显飘移。好在现在有一些焦点稳定系统，如OLYMPUS的IX81-ZDC，就可以稳定焦点位置，不管温度如何变化。所以大的培养箱不是必须的，小的更好。

至于水气的问题，我很少听用户抱怨过。因为一般小的培养箱上下都的玻璃都是加热玻璃，不是很容易凝结水气的。

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2008-10-04 20:56 | 只看楼主 树型| 收藏| 小中大 3^#

是的。但是方法不是用温度探头。因为温度变化与焦距之间的关联并不固定。
采用的方法有些类似照相机自动聚焦的原理，使用IR激光打到玻片上，检测反射回来的激光变化就可以监视焦距变化了。然后建立一个反馈系统，如果焦距发生变化了，则进行调整，直到返回到初始位置。

其实原理并不复杂

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2008-10-04 20:56 | 只看楼主 树型| 收藏| 小中大 4^#

其实这些系统都不去锁定细胞的，因为细胞在变化。大家锁定的一般都是从培养皿底部玻片反射回来的光。这个层面是不会变化的。

所以这样的系统对于运动比较快的细胞并不完全适合，尤其细胞会上下运动的情况，焦点是不能保证的。贴壁的细胞最好。

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2008-10-04 20:57 | 只看楼主 树型| 收藏| 小中大 5^#

还是以上的两个问题：1、细胞总是会长的嘛，不能跟踪细胞的生长吗？2、标记玻片底部，那么在使用油镜的情况下，相对玻片，油对温度变化更为敏感，还能保证不失焦吗？

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2008-10-04 20:57 | 只看楼主 树型| 收藏| 小中大 6^#

好专业的问题！
我试着再回答一下，再深我就溜之大吉喽

1。跟踪细胞的生长：已经是另外一个概念了，如果配合电动扫描平台和专业的图像软件，可以实现在XY平面内的跟踪。当然如果细胞的生长没有超出一个视野，不需要电动扫描平台，用软件也可以做跟踪分析。但限于XY平面内的分析。

2。油的影响：的确存在，但温度对油的影响因素中，体积的变化在此可以不考虑，需要关心的是温度变化对油的折射系数的影响。如果这个影响比较大，则也会影响探测激光的返回时间。但是所幸，目前还没有发现这种影响比温度对镜体的影响大。所以仍然在采用此方法。我估计在更好的方案出来前，长期会采用吧

另外，补充说明。我不是说这种补偿系统不能用于细胞的动态观察，只是强调如果细胞本身做上下的沿光轴方向运动的话，补偿系统不能跟踪这种运动。但我见过有牛人，使用快速的Z轴马达，在每个时间点上都作一个Z轴的序列，最后得到一系列的XYZT图像，这样每个时间点可以得到3D的信息（通过软件重组），即便细胞有Z轴上的运动，每个焦层面仍然被采集到了。够牛吧！

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2008-10-04 20:58 | 只看楼主 树型| 收藏| 小中大 7^#

如果质量高点的显微镜是不会因这些正常范围内的温度改变而改变显微镜机械调焦的偏移（漂移）的。对于长期观察细胞来说，主要问题是因细胞生长或细胞因周围环境变化而造成的细胞本身焦平面的变化，这目前就我个人认为还没很好的办法，当然可以试用自动聚焦方法对焦所观察的细胞平面（不是楼上说的那种靠红外定位玻片位置的方法），但问题是光学认为对焦的平面往往不是观察者所关心的平面，特别是DIC图象，更加如此（不复杂描述了，因为这要牵涉到光学对焦原理内容太多）。荧光图象也是往往如此。所以目前应该说没有很好的办法。当然可以试一下用低倍物镜，景深可以大点，可以改善点效果。

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2008-10-04 20:58 | 只看楼主 树型| 收藏| 小中大 8^#

Quote:引用第17楼远山于2008-01-31 23:10发表的 :
如果质量高点的显微镜是不会因这些正常范围内的温度改变而改变显微镜机械调焦的偏移（漂移）的。。。。。。。

还是有些不同意版主的观点，至少到目前为止，我还没有看到可以避免“温度引起焦点漂移”的显微镜。就连号称显微镜品牌No1的Z的显微镜一样会漂，而且漂的一点不比其他品牌少。

如果真有这么高质量的显微镜，那也就不需要那么多厂家提供防焦点漂移的系统了。

我想用户的经验应该更丰富也更直接。建议版主搞个投票帖，统计有多少人遇到过漂移，都是哪个型号的显微镜。

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2008-10-04 20:58 | 只看楼主 树型| 收藏| 小中大 9^#

讨论显微镜的失焦问题?包括机械失焦(显微镜内部)和温度失焦(外围环境),据说温度失焦是各个厂家都没能解决的问题,只是尽量避免,机械失焦已经有解决的了

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2008-10-04 20:59 | 只看楼主 树型| 收藏| 小中大 10^#

Olympus的焦点零漂移补偿系统ZDC（Zero Drift compensate）和Nikon的完美聚焦系统PFS（Perfect Focus system）的工作原理差不多，都是通过红外或近红外光来监测焦面的变化。
从光源过来的光经过ZDC/PFS后被过滤为对细胞伤害较小的红外/近红外光，光线经过物镜后照射到标本上再返回到ZDC/PFS，被系统里的CCD采集到；CCD感受到的是光斑的大小，但反映出来的是物镜到标本平面距离的变化。在一定的距离范围内，CCD会认为是在焦面，如果超出这个范围，系统就会自动调整物镜的升降以回到正常的范围内。但是在使用时要先调好焦面，让ZDC/PFS记住这个焦面位置，否则ZDC /PFS 就不能很好的工作了。

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